Edward
Analyse des huiles essentielles par chromatographie sur couche mince et évaluation de leur pouvoir antioxydant
Définition huile essentielle:
appelées aussi essence végétale le liquide concentré et hydrophobe
des composés aromatiques (odoriférants) volatils d'une plante. Il est obtenu
par extraction
mécanique, entraînement
à la vapeur d'eau ou distillation à sec.
But de TP
- L’extraction d’une huile essentielle par entrainement à la vapeur.
- L’analyse qualitative d’une huile essentielle par chromatographie sur couche mince CCM.
- L’évaluation du pouvoir antioxydant in vitro par le test du DPPH.
Partie théorique
1. Étapes de l’extraction des huiles essentielles par l’entrainement à la vapeur
La majorité des huiles essentielles est obtenue par
distillation à la vapeur d'eau, sans détartrant chimique et sous basse pression.
Le procédé
consiste à faire traverser une cuve remplie de plantes aromatiques par de la
vapeur d'eau. La vapeur d'eau extrait l'essence de la plante et forme avec elle
un mélange gazeux homogène. A la sortie de la cuve et sous pression contrôlée,
la vapeur d'eau enrichie d'huile essentielle traverse un serpentin et se
condense. Le liquide aboutit dans l'essencier (vase florentin) où l'huile
essentielle de densité inférieure à celle de l'eau.
Procèdes d’extraction des huile essentielles par
l’entrainement à la vapeur
2. Analyse qualitative des huiles essentielles par CCM
La chromatographie est une méthode
d’analyse simple permettant
- De séparer les espèces chimiques contenues dans une substance.
- D’identifier ces espèces par comparaison avec une référence.
2-1- Principe :
Le mélange est fixé sur un support appelé phase
stationnaire (un gel de silice déposé en couche mince sur une plaque
d'aluminium). Il est entraîné par un solvant approprié (phase mobile ou
éluant) qui migre par capillarité sur la plaque. Dans la goutte, sont présents
plusieurs composés dont certains sont polaires (P), d'autre moins, ou apolaires
(A). Si l'éluant choisi est polaire, il fera migrer plus facilement le composé
P, ayant plus de facilité à l'emmener dans la phase mobile.
Les constituants du mélange se séparent par
migration différentielle : chacun d'eux est d'autant plus entraîné par l'éluant
qu'il est plus soluble dans celui-ci et moins adsorbé sur la phase
stationnaire. Après migration les taches doivent être révélées ; c'est la détection
qui peut se faire soit :
·
Pulvérisation
d'un réactif caractéristique.
·
Par
observation à la lumière UV si la plaque de silice comporte un indicateur de
fluorescence.
A chaque tâche
correspond une espèce chimique, deux tâches situées à la même hauteur
correspondent à la même espèce chimique. (J. Touchstone et al., 1983).
2-2-
Eléments nécessaire pour réaliser une CCM :
v Une cuve chromatographique : un récipient habituellement en
verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche.
v La phase stationnaire (Support
fixe) : une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice, fixée sur une plaque d’aluminium,
à l’aide d’un liant.
v L’échantillon : environ
un microlitre de solution diluée du mélange à analyser, déposé en un point
repère situé au-dessus de la surface de l’éluant.
v
L’éluant (phase mobile) : un solvant. Il faut le plus souvent faire
des essais de séparation avant de se lancer vraiment dans l’analyse
chromatographique. On retiendra tout de même qu’un solvant polaire entraînera
facilement les substances polaires et peu les substances apolaires.
3. Principe du dosage par spectrophotométrie UV-visible :
La spectrophotométrie est une méthode
analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité
optique d'une substance chimique donnée en solution. Plus cette espèce est
concentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalités
énoncées par la loi de Beer-Lambert. La densité optique des solutions est
déterminée par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur
d'onde d'absorption de l'espèce chimique à étudier. Lorsqu’une lumière
d’intensité
passe
à travers une solution, une partie de celle-ci est absorbée par le(s)
soluté(s). L’intensité I de la lumière transmise est donc inférieure à
. L’absorbance de la solution est définie
comme suit :
L’absorbance est une valeur positive, sans
unité. Elle est d’autant plus grande que l’intensité transmise est faible. Les
méthodes colorimétriques basées sur l’utilisation du spectrophotomètre
UV-visible, ont été utilisées pour évaluer la quantité des composés phénoliques
dans la matière végétale. (MUANDA, F. N. 2010).
4. Principe de l’évaluation de l’activité antioxydants par test DPPH :
Le test au 2,2-diphényl-2-picryl-hydrazyle (DPPH.)
permet de mesurer le pouvoir réducteur par le calcul de la CI50 des substances
antioxydants contenues dans un extrait. La réduction du radical libre DPPH par
un antioxydant peut être suivie par spectrophotométrie UV-visible, en mesurant
la diminution de l’absorbance provoquée par la présence des extraits. Le DPPH
est initialement violé, et devient jaune quand il est réduit par un donneur de
proton H+. (Parejo et al, 2002).
Dans ce test, le substrat
est un radical stable qui, en réagissant avec une molécule antioxydante, se
transforme en DPPH-H (2,2-diphényl-1-picrylhydrazine) avec perte de son absorbance
caractéristique à 517 nm. Les réactions ont lieu à température ambiante et en milieu
éthanolique, qui permet une bonne solubilisation de la plupart des
antioxydants. Ce test est très utilisé, car il est rapide, facile et non
couteux.
Partie pratique
1-
Caractérisation
qualitative des huiles
essentielles par CCM :
Préparation de la plaque :
La plaque CCM a comme phase stationnaire le Silicagel
60 F254 Merck (Support en Aluminium) qui contient un indicateur coloré
devient inflorescent à 254nm .Cette plaque est coupée selon les dimensions
suivantes : la hauteur : 10 cm et la largeur : 20 cm
Dépôt de produit : les produits sont déposés à l’aide des
capillaires en bandes à 1.5 cm du fond et du bord de la
plaque tout en respectant les quantités suivantes : pour les huiles
essentiels on dépose 5µl et pour les témoins on dépose 10µl sauf pour le
Carvacrol 20µl car il est très volatil.
Préparation de l’éluant :
La cuve doit être saturée
en Acétate d’éthyle-toluène R (7-93 V/V) avant d’y plonger la plaque CCM.
Révélation et conservation de la plaque :
La révélation se fait d’abord à
254 et 360 nm puis par le réactif Anisaldéhyde-Acide sulfurique
puis chauffage à 105°C.
2-
Etude de pouvoir antioxydant
par le test de DDPH :
Préparation des solutions :
On a travaillé sur l’huile essentiel de Thymus satureioides comme solution mère de la
concentration 50 mg/ml, après on a préparé une série de dilution comme le schéma ci-dessus :
En se basant sur les dilutions précédentes et à partir de
chaque micro tube on prépare trois répétition chacune contienne 50 µl et on
rajoute 2 ml de DPPH.
On a besoin d’un tube témoin pour régler le zéro
d’absorbance qui contient 50ul de méthanol et 2 ml de DPPH.
A partir d’une solution mère de la Quercétine d’une
concentration 160 µg/µl, on prépare des dilutions de la même manière précédente
et pour chaque dilution on réalise trois répétitions (50ul de chaque dilution +
200ml DPPH).
Les échantillons sont ensuite laissés dans l’obscurité
pendant 20 minutes. La DO est mesuré à 517 nm.
Résultats et discussions
I. La chromatographie sur couche mince :
1. Présentation de la plaque de CCM
Plaque de Chromatographie après révélation
Support : Silicagel 60 F254 Merck (Support en Aluminium)
Phase mobile : Acétate d’éthyle-totuène R (7-93 V/V)
Détection : Avec le réactif Anisaldéhyde-Acide sulfurique puis chauffage à
105°C
Annotation : [
] coloration
violette avec le réactif.
Dépôt :
P : Pulégone
(quantité déposée : 10µl)
L : Linalool (quantité déposée : 10µl)
E : Eucalyptol (quantité déposée : 10µl)
C : Carvacrol (quantité déposée : 20µl)
T : Thymol (quantité déposée : 10µl)
|
TS : Thumus satureioides (quantité
déposée : 5µl)
SO : Salvia officinalis (quantité déposée : 5µl)
RO : Rosmarinus officinalis (quantité déposée : 5µl)
Msp : Mentha sp (quantité déposée : 5µl)
Lsp : Lavendula sp (quantité déposée : 5µl)
|
2. Calcul du rapport frontal :
Rapport frontal des taches obtenues :
Rf = (Distance parcourue par la soluté (x) ) / (Distance parcourue par le solvant (y))
II. Résultats de l’activité antioxydante
Calcul des pourcentages de réduction :
Le pourcentage
de réduction est calculé selon la relation suivante :
AA%= ( (DO contrôle - DO échantillon) / DO contrôle ) ) * 100
CONCLUSION
L'étude de la composition chimique des huiles essentielles par chromatographie sur couche permis d'identifier x constituants, dont le composé majoritaire est x . Les résultats du test de l’activité antioxydante au DPPH ont révélé que les huiles essentielles du x présentent une activité antioxydante très importante. Cette étude contribue à la connaissance des potentiels antioxydants in vitro de Deverra scoparia, il serait également intéressant de réaliser d’autres études pour évaluer le potentiel antioxydant de ces huiles in vivo.
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